GM130とそのゴルジ膜上でのレセプターである事が示唆されているGRASP65のゴルジ膜への局在化機構の解析を行った。(1)^<35>S-メチオニンをトレーサーとし、細胞分画法でゴルジ体分画への局在を経時的に解折したところ、GM130とGRASP65は合成後すみやかにゴルジ体へ局在化することがわかった。(2)新規合成タンパク質の局在化を形態学的に調べたところ、小胞体からゴルジ体への輸送をmSar1pの生細胞への微細注入によって阻害した条件でもGM130とGRASP65のゴルジ体への局在化が観察された。(3)試験管内転写翻訳系を用いて合成したGM130とGRASP65は、精製したゴルジ体膜へ特異的に結合した。以上の結果から、GM130とGRASP65が翻訳後、直接ゴルジ体に局在化する事が明らかとなった。GM130及びGRASP65がいずれも小胞体を介さずに直接ゴルジ体に局在化することは、GM130とGRASP65の複合体が、ゴルジ体の分極を規定する構造体を構成する分子である可能性を支持していると考えられた。次に、GM130、GRASP65の局在に関与する可能性のある複数回膜貫通タンパク質(Yip1p)のファミリーがゲノム情報データ・ベースに存在する事を発見し、これらの解析を行った。その一つがゴルジ体に局在し、細胞への過剰発現によってゴルジ体を細胞質に分散させることを発見し、現在そのメカニズムを解析中である。また最近、細胞を低いpHにさらす事によって、ゴルジ体が急速に細胞質に分散する現象を発見した。現在この処理のGM130、GRASP65への効果を解析するとともに、これらのタンパク質のゴルジ体分散への役割について解析を行っている。
The localization mechanisms of GM130 and its presumed receptor, GRASP65 to the Golgi apparatus were investigated. (1) By pulse-chase subcellular fractionation experiments using <35>^S-methionin, it was revealed that GM130 amd GRASP65 localize to the Golgi apparatus soon after the synthesis. (2) Morphological analysis revealed that newly synthesized GM130 and GRASP65 were localized to the Golgi apparatus under the condition the transport form the ER to the Golgi apparatus was inhibited by the microinjection of mutant Sarlp. (3) In vitro translated GM130 and GRASP65 specifically bound to the purified・Golgi membrane. These results indicated that GM130 and GRASP65 localize to the Golgi apparatus directly without initial targeting to the Golgi apparatus suggesting that GM130 and GRASP65 are the candidate structural protein that support the polalization of the Golgi apparatus. The genes for Yiplp family transmembrane proteins which are candidates for the determinant of the localization of GM130 and GRASP65 were identified from genome data base. One of the family member proteins localized at the Golgi apparatus and its over expression disassembled the Golgi apparatus. The molecular mechanism for the Golgi disassembly is now under investigation. The Golgi apparatus is also disassembled after the treatment of cells with low pH medium. The effect of this treatment for GM130 and GRASP65 are currently investigated.
コイルド・コイルタンパク質による小胞輸送調節機構の解析
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CA-PR-NAKAMURA-N-kaken 2003-2p.pdf
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