2026-03-11T10:56:31Z https://kanazawa-u.repo.nii.ac.jp/oai

oai:kanazawa-u.repo.nii.ac.jp:00054229 2024-07-01T06:22:55Z 2812:2813:2829

磁性細菌のGタンパク質融合型鉄輸送体: 精製と再構成 60135655 福森, 義宏 1.N-FeoBの大量発現と抗N-FeoB抗体の作製 FeoBを精製するには、高感度なアッセイ系が必要である。そこで、本年度は、抗-FeoB抗体を作製した。具体的には,FeoBのN末端ドメイン(245アミノ酸残基)をコードするDNA断片をPCRで増幅、PCRエラーが無いことを確認し、pET-15b vectorにクローニングした。大量発現には大腸菌BL12株を用いた。N-FeoBは封入体として発現しており、大腸菌より封入体を調製し、変性条件下でNiアフィニティクロマトグラフィにより精製した。大量発現の結果得られたN-FeoBをトロンビンで処理しHis-tag部分を取り除き、SDS-PAGEしたゲルから切り出すことで、更に精製した。得られた精製標品を抗原としてウサギに免疫した。抗体価は二重免疫拡散法とドットブロット法により測定し、アッセイに十分な抗体価をもつ抗血清が得られた。 2.磁性細菌M.magnetotacticumの大量培養と膜画分の調製 M.magnetotacticumを120Lの合成培地で培養し、25gの細胞を得た。細胞をフレンチプレスで破砕し遠心分離(8,000xg)によって未破砕細胞とマグネトソームを取り除き、更に、超遠心(100,600xg)し沈澱を回収することで膜画分(細胞膜と外膜を含む)を調製した。 3.FeoBの検出 抗N-FeoB抗体を用いてWestern blotを行い、M.magnetotacticumの膜画分からFeoBの検出を行った。その結果、73.6kDaのメジャーなバンドと2つのマイナーバンド(81.5,61.1kDa)が確認できた。メジャーなバンドの分子量はfeoB遺伝子の塩基配列から推定される分子サイズとほぼ一致した。このことから本細菌のFeoBは膜画分に存在していることが明らかになった。 4.FeoBの精製(可溶化条件の検討) FeoBの精製を行う為、膜可溶化条件を検討した。可溶化効率はWestern blotによって検出したバンドをルミノイメージアナライザーによって定量し、求めた。その結果、デオキシコール酸ナトリウムが最も効率的にFeoBを可溶化できることが分かった。現在,アフィニティ、イオン交換、ゲルろ過、ハイドロキシルアパタイトカラムクロマトグラフィによりFeoBの精製を試みている。 研究課題/領域番号:16048211, 研究期間(年度):2004 出典：「磁性細菌のGタンパク質融合型鉄輸送体: 精製と再構成」研究成果報告書　課題番号16048211 （KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） （https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-16048211/)を加工して作成 金沢大学理工研究域 2018-03-21 jpn research report AM https://doi.org/10.24517/00060505 http://hdl.handle.net/2297/00060505 https://kanazawa-u.repo.nii.ac.jp/records/54229 10.24517/00060505 https://kaken.nii.ac.jp/ja/search/?kw=60135655 https://kaken.nii.ac.jp/ja/search/?kw=60135655 https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-16048211/ https://kaken.nii.ac.jp/ja/grant/KAKENHI-PROJECT-16048211/ 平成16(2004)年度 科学研究費補助金 特定領域研究 研究概要 2004 Research Project Summary 2004 1p. https://kanazawa-u.repo.nii.ac.jp/record/54229/files/SC-PR-FUKUMORI-Y-kaken 2018-1p.pdf application/pdf 142.3 kB 2021-06-10