@techreport{oai:kanazawa-u.repo.nii.ac.jp:00034794,
 month = {Mar},
 note = {The amino acid sequences of the two isozymes of Rhus vernicifera laccase were determined from their cDNA's and the amino acids to construct the four copper-binding sites and the N-type carbohydrate-binding sites were determined. Tree laccase was expressed as an inclusion body in E.coli. When Pichia pastoris was used as host, laccase was transcribed as mRNA but was not translated as protein. Therefore, laccase gene was designed and synthesized to be suitable for the heteologous expression of the tree enzyme in prokaryote and yeast. The novel heteologous expression system of bilirubin oxidase was constructed using Pichia pastoris as host. The recombinant enzyme obtained by using this overexpression system showed more than twice enzyme activity than the authentic enzyme, and also showed high thermostability, being suitable to use for the clinical test of liver. Various bilirubin oxidase mutants were formed using this novel expression system. The substitutions of the His residues for type 3 Cu's by the coordinating amino acids such as Lys and Asp gave mutants whose enzyme activities were much decreased. The mutation on the Asp residue positioned near the trinuclear center was fatal as to give the reduced Cu content. Therefore, it appears that this amino acid as a potential proton source is also indispensable to construct the trinuclear center. The mutation of Cys for type I Cu gave the mutant in which type 1 Cu site was vacant, allowing us to trap a reaction intermediate, dioxygen-reduced species, which was not detected during the reaction of the authentic enzyme., マルチ銅オキシダーゼは呼吸鎖の末端酸化酵素とともに酸素を4電子還元することのできる三核鋼部位を有している。基質から引き抜いた電子を酸素にトランスファーする過程において、活性酸素を系外に放出することなく水にまで変換することがこの酵素群の機能の特徴である。本研究ではまず、マルチ銅オキシダーゼのプロトタイプ酵素であるウルシラッカーゼのアミノ酸配列を初めて決定し、銅結合に関わるアミノ酸を特定した。次いで、ウルシラッカーゼの異種発現に挑戦し、大腸菌を宿主とし封入体を発現させた。また、酵母を宿主とする系の構築にも挑戦し、mRNAに転写させることに成功した。しかし、コドンの使用頻度の問題で、植物酵素を翻訳させることは困難であることが判明したので、大腸菌や酵母での発現に適した人工遺伝子を作成し、発現を試みているところである。一方、肝機能の検査に利用されているビリルビンオキシダーゼについても、酵母を宿主とする発現系に構築に挑戦し、大量発現系の構築に成功した。この組換え体は現在臨床検査に用いられている野生型酵素よりも活性が高く、また、安定性にも優れており、実用レベルに達していた。この異種発現酵素は野生型酵素とは幾分異なる磁気的性性質を示したが、1度ターンオーバーすると、野生型酵素と同じ休止状態に至ることがわかった。次いで、酸素結合部位および酸素の還元にかかわると思われるアミノ酸に変異導入した。タイプ3銅へのヒスチジン残基を配位性のアミノ酸に置換にしたところ、酵素活性は低下するが酵素活性は維持していることが判明した。また、酸素へプロトンを供給すると考えられるアスパラギン酸を変異させたところ、活性部位そのものが形成されないことから、このアミノ酸は構造形成にも寄与していることが判明した。さらに,タイプ1銅部位が空となった変異体を作成し、酸素還元中間体を長時間トラップすることに成功した。, 研究課題/領域番号:13440194, 研究期間(年度):2001–2003, 出典：「銅含有酵素におけるマルチ銅センターの構造・機能相関」研究成果報告書　課題番号13440194
  (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)
　　　本文データは著者版報告書より作成},
 title = {銅含有酵素におけるマルチ銅センターの構造・機能相関},
 year = {2004}
}