@techreport{oai:kanazawa-u.repo.nii.ac.jp:00034808,
 month = {Mar},
 note = {ミオシンVのプロセッシビティ:基板に固定されたアクチンフィラメントに沿ってミオシンVが1分子で連続的(プロセッシブ)に長距離運動することを明確に証明した。この研究成果を出発点にして本研究は展開された。ミオシンVのプロセッシブ運動の詳細解析:ステップ変位間のDwell TimeのATP濃度依存性を求め、そのヒストグラムを2つの連続反応を仮定して解析した。k_1/[ATP]=0.4s^<-1>M^<-1>,k_2=18s^<-1>を得た。k2はATPase活性1.2s^<-1>/headと大きく異なり、2つの連続反応が、律速であるADP放出、ATPの結合という2過程では説明できないことを示した。単頭ミオシンVの調製と性質:+Ca^<2+>でのProteinase K処理により単頭(S1)を調製できることを見つけ,S1はプロセッシブでないことを示した。双頭HMMのS1からの再構成:柔らかいPEG鎖2本でS1を繋ぎ双頭HMMを再構成し、片方のネック領域のみを蛍光ラベルして、その蛍光輝点の運動を解析した。このHMMはプロセッシブであり、ステップ変位の大きさは約70nmであった。柔らかい鎖で繋がれた2つの頭部は力学的に緩くしか互いを束縛しておらず、前方の頭部の構造変化により後方の頭部は前方に繰り出されるという所謂Swinging Lever-arm説では説明できない。また、ステップサイズは両頭部が跨げる距離(82+36)nmの2倍にはならずアクチンフィラメントの螺旋ピッチにほぼ一致した。高速AFMによるミオシンVのナノ動態撮影:Caged-ATPからATPを放出する前後のミオシンVの動態を撮影し、ATPの放出と同期して頭部がネックとの境界部で大きく屈曲し1,2秒の内に元に戻ることを見出した。アクトミオシンVの撮影では、片方の頭部がアクチンと結合後速やかに変位運動することを見出した。これもSwinging Lever-arm説では説明できない。無生物(ビーズ)の運動:ミオシンVと直径約3nmのビーズが共存すると、ビーズがアクチンフィラメントに沿ってプロセッシブ運動することを見出した。この現象は、ミオシンVが変位するとき片方の頭部(変位する頭部)がアクチンから解離するというモデルでは説明できない。変位する間アクチンと結合したままであることを強く示唆している。, Processivity of Myosin V : We evidenced that single molecules of myosin V move processively along actin tracks attached to a substratum. The present research project was developed based on this finding. Analysis of Myosin V Processive Movement : Dependence on the ATP concentration of the dwell time between adjacent step-wise displacements was obtained. The histogram of the data was analyzed assuming two continuous reaction steps, which resulted in k_1/[ATP]=0.4 s^<-1>M^<-1>,k_2=18 s^<-1>. The value of k_2 is much larger than the ATPase rate, 1.2s^<-1>/head. Therefore, the two continuous reactions cannot be interpreted as the ADP-release step and the subsequent ATP-binding step. Preparation and Characterization of Single-headed Myosin V : We found that single-headed myosin V(S1) was able to be prepared by digesting myosin V with proteinase K in the presence of Ca^<2+>, and then found that S1 was not processive. Reconstruction of Double-headed HMM from S1 : HMM was reconstructed by linki ng two S1s with two flexible PEG chains. One of the head was labeled with a fluorophore, and then its movement along actin filaments was observed. We found that this HMM was processive, and its step size was about 70nm. The two heads linked via flexible PEG chains do not mechanically constrain each other. In the swinging leverarm model, bending of the leading head is supposed to detach the trailing head from actin and bring it forward. Therefore, the movement of this HMM cannot be accounted for by this model. In addition, the step size(70nm) is much smaller than the maximum span(i.e.,2x(70+36)nm), and approximately coincides with the helical pitch of an actin filament. High-speed AFM imaging of nanometerscale dynamic behavior of HMM : Using a high-speed AFM we imaged myosin V before and after releasing ATP from caged-ATP. We found that the head of myosin V bent quickly soon after releasing ATP, and returned to the original conformation in 1-2s. With acto-myosin V we found following events to take place ; soon after one head of myosin V was attached to an actin filament, the head dislocated along the actin filament. This behavior cannot be explained by the swinging leverarm model. Movement of an inanimate object(bead) : When both beads and myosin V were present, the beads moved processively along actin tracks. This observation cannot be accounted for by a model that assumes detachment from an actin filament of the head that is moving forward, and strongly suggests that the head is moving forward, keeping in contact with an actin filament., 研究課題/領域番号:12480198, 研究期間(年度):2000–2002, 出典：「脳ミオシンVの化学・力学カップリング」研究成果報告書　課題番号12480198
  (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)
　　　本文データは著者版報告書より作成},
 title = {脳ミオシンVの化学・力学カップリング},
 year = {2004}
}