@techreport{oai:kanazawa-u.repo.nii.ac.jp:00043712,
 month = {Mar},
 note = {HCVの持続感染の遮断が肝がん発症のリスクを低下させると期待される。RNA依存RNA合成酵素(RdRP)であるNS5BはHCV複製遮断の有力な標的である。NS5Bに集約型(Cm)及び置換型(Pm)変異を導入しRdRP活性の検討を行い、RdRP活性に必須な5残基を新たに報告した。本研究では、RdRP活性と構造の研究を進め、NS5Bと相互作用するHCV NS5Aと宿主蛋白ヌクレオリンのRdRP活性への影響と、in vitroで得られた知見がHCV複製に与える影響を解析し、以下の成果を得た。
1)NS5Bがオリゴマー化することを見い出し、Cm変異解析によりオリゴマーに必須な2残基は、活性中心より離れたRdRP活性に必須な2残基と一致した。これはRdRP活性にオリゴマー化が必須であることを示した。2)NS5BとNS5Aの特異的結合を見い出し、NS5Bの4配列とNS5Aの2つの領域が相互作用に必要である。精製NS5Aは少量でRdRP活性を促進し、多量でRdRP活性を阻害した。3)我々は、ヌクレオリンとNS5B相互作用を見い出し、2蛋白の相互作用領域を限定した。この結合がNS5Bの細胞内局在に影響を与えた。4)MILE HCV RNAレプリコン系を用いて解析した結果、RdRP活性に必須な5アミノ酸残基がHCV複製に必須であった。5)HCV RNAレプリコン系にNS5AのNS5B結合領域にCm或はPmを導入した解析で、NS5B結合変異NS5AではHCV複製が起きず、NS5AとNS5Bとの相互作用がHCV複製に必須であることを強く示唆した。6)ヌクレオリンとNS5Bの相互作用の影響をHCV RNAレプリコン系で検討した。ヌクレオリン結合領域にCm或はPmを持つレプリコンは、HCV複製が起きないか極端に低下していた。SiRNA法でヌクレオリン発現が一時的に低下した細胞では、Hcv複製が1/3-1/4程度に低下した。, Eradication of HCV persistent infection may prevent or delay incidence of hepatocellular carcinoma. HCV NS5B is RdRP that is a strong target to eradicate HCV replication. In hope to find novel strategies, we had identified 5 residues of NS5B critical for RdRP activity by introducing clustered alanine substitution (Cm) and point alanine substitution. This grant aims to get further insight of structure and function of RdRP enzyme, to characterize NS5B-interacting partners, NS5A and a host factor nucleolin, and finally to evaluate these interactions and mutations of NS5B on HCV RNA replication using a HCV RNA replicon system. Followings are the results we obtained.
1)Oligomer formation of NS5B was observed and two residues were defined by scanning the Cm and Pm libraries to be critical for oligomer formation. Interestingly the two residues are among the residues indispensable for RdRP activity, strongly suggesting that oligomeric interaction might be prerequisite for RdRP activity. 2)Speci fic interaction between NS5B and NS5A was found. The critical regions of the two factors for the interaction were mapped, 3)We found NS5B truncated at C-terminal was enriched in nucleoli. Nucleolin was defined to the interacting factor with NS5B. The NS5B-binding fragments did not affected much RdRP activity, although the interaction affected the subcellular localization of NS5B. 4)We evaluated whether the critical 5 residues for RdRP in vitro are indispensable for HCV replication using MlLE HCV RNA replicon. Actually all the residues are absolutely required for HCV replication. 5)Using HCV replicon harboring mutations of NS5A that are defective in NS5B-binding, we evaluated the role of the NS5A-NS5B interaction in HCV replication. Cm mutants and some Pm mutants within the regions necessary for NS5B-binding could not support HCV replication, strongly suggesting the importance of the inter action. 6)We evaluated the interaction of nucleolin and NS5B in the HCV RNA replicon system. Cm mutant of NS5B defective in nucleolin-binding could not support efficient HCV replication. Transient knock-down of nucleolin with siRNA greatly reduced the G418-forming foci, strongly suggesting that the interaction of nucleolin and NS5B is critical for HCV replication., 研究課題/領域番号:14370054, 研究期間(年度):2002-2004, 出典：「C型肝炎ウイルス(HCV)複製酵素(NS5B)と製御因子NS5Aの機能解析」研究成果報告書　課題番号14370054
  (KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）)
　　　本文データは著者版報告書より作成},
 title = {C型肝炎ウイルス(HCV)複製酵素(NS5B)と製御因子NS5Aの機能解析},
 year = {2005}
}