@techreport{oai:kanazawa-u.repo.nii.ac.jp:00050720,
 month = {May},
 note = {本研究は、糖尿病血管症などの病態に重要な細胞表面受容体RAGE(receptor for advanced glycation endproducts)により活性化される細胞内シグナルの解析を通してRAGEによるシグナル生成機構を明らかにすることを目指し、当初計画に沿って遂行され、以下の成果を得た。
(1)全長型RAGE発現細胞と、細胞内ドメイン欠失RAGE発現細胞をAGEによって刺激した所、全長型RAGE発現細胞でのみチロシンリン酸化が亢進するタンパク質が複数同定された。その一部は、新たなRAGE依存性チロシンリン酸化タンパク質と考えられたため、質量分析により数個の候補タンパク質を同定した。
(2)各種の酵素阻害剤を用い、これらのタンパク質のチロシンリン酸化はERKの上流もしくは別個のシグナル伝達経路に位置し、チロシンホスファターゼによる制御を受けているものがあることを明らかにした。
(3)RAGE発現細胞をAGEで刺激後、クロスリンカーにより細胞表面上で隣接しているタンパク質同士を架橋し、抗RAGE抗体で免疫沈降を行った。次に還元剤処理によりクロスリンカー分子内のジスルフィド結合を切断した後、ウェスタンブロットによりチロシンリン酸化タンパク質を検出した。その結果、複数のチロシンリン酸化タンパク質がRAGEと複合体を形成してることが示された。
(4)上記チロシンリン酸化タンパク質の一部はAGE刺激によりチロシンリン酸化が亢進し、刺激時間依存性およびAGE濃度依存性が認められた。また、(1)で同定されたタンパク質と一致する分子量を示すものもあった。
(5)全長型RAGE、またはを細胞内ドメイン欠失RAGEを発現している細胞をAGEで刺激後、既知チロシンキナーゼ型受容体のチロシンリン酸化をアッセイする抗体アレイで解析したところ、AGE刺激依存性にチロシンリン酸化が亢進する受容体が見出された。, RAGE (receptor for advanced glycation endproducts) is a cell surface receptor that bind several ligands, such as AGE (advanced glycation endproducts), HMGB-1 (high molecular group box-1 protein), amyloid beta. The intracellular signals evoked by RAGE-ligand interaction were thought to play pivotal roles in development of various diseases. However, the mechanism of generation of intracellular signals by RAGE was poorly understood.
In this research we revealed the presence of novel signaling pathway that is activated by the association of RAGE (receptor for advanced glycation endproducts) with its ligands. The pathway appears to involve tyrosine phosphorylation. We also found tyrosine-phosphorylated proteins that associate with RAGE on cell surface.
(1) We found increased tyrosine-phosphorylation of several proteins after ligand stimulation. Their phosphorylation requires cytoplasmic domain of RAGE because the increase of tyrosine-phosphorylation was not observed in a cell line that expres s cytoplasmic domain-deleted RAGE. We identified several candidates of those proteins by mass-spectrometry.
(2) We revealed that the stimulation-dependent tyrosine phosphorylation event was located upstream of ERK activation or on ERK-independent signaling pathway, using kinase inhibitors. Furthermore, tyrosine phosphorylation of a few proteins was regulated by tyrosine phosphatase.
(3) We found that several tyrosine-phosphorylated proteins associated with RAGE on cell surface using cross-linking followed by immunoprecipitation.
(4) We found that the tyrosine phosphorylation of the RAGE associated proteins was enhanced by ligand stimulation in dose-dependent and time-dependent manner. These proteins might be co-receptors of RAGE.
(5) We identified a known whose tyrosine-phosphorylation was enhanced by RAGE ligands using antibody array that evaluate tyrosine phosphorylation of known receptor tyrosine. A few known receptor tyrosine kinases were constitutively activated by full-length RAGE or cytoplasmic domain-deleted RAGE. These receptors might be involved in RAGE dependent-signaling pathways., 研究課題/領域番号:16570113, 研究期間(年度):2004-2005, 出典：「多機能受容体RAGEによるシグナリングネットワークの解明」研究成果報告書　課題番号16570113
（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所））
  本文データは著者版報告書より作成, 金沢大学医学系研究科},
 title = {多機能受容体RAGEによるシグナリングネットワークの解明},
 year = {2006}
}