@techreport{oai:kanazawa-u.repo.nii.ac.jp:00057709,
 month = {Mar},
 note = {最近MutSミスマッチ結合蛋白を応用して様々な部位に異常があっても高感度に遺伝子異常の有無を検出できることがLishanskiらやWagnerらにより実験的に示されている。そこで、膵癌細胞株と膵癌ならびに慢性膵炎患者よりの膵液よりDNAを抽出した。一方、K-ras exon1、p53のexon5〜8のそれぞれに対するビオチンを標識したプライマーを作成した。PCRにて増幅後、熱変性、再アニーリング処理を行ない、遺伝子異常がある場合は二本鎖heteroduplexが形成されるが,それがない場合は二本鎖homoduplexのみが形成される。ニトロセルロース膜上に固相化したMutS蛋白と反応させ,二本鎖heteroduplexを特異的に認識して結合するというMutS蛋白の性質を利用して,MutS蛋白に特異的に結合した変異を含むミスマッチPCR産物をストレプトアビジンHRPを用いた化学発光(ECL)検出法にて検討した。4つの膵癌細胞株(PANC-1,PaCa-2,BxPC-3,HPAF)のうち、K-rasコドン12のhomozygous mutationsを示すPaCa-2と、K-ras変異のないBxPC-3は、2本鎖DNAが相補的であるため、理論上homoduplexのみしか形成されない。一方、PANC-1,HPAFはheterozygous mutationであるので、heteroduplexを形成すると考えられる。p53変異についても、それぞれの膵癌細胞株において、PANC-1(exon8)、PaCa-2(exon7)、BxPC-3(exon6)、HPAF(exon5)の変異が確認されており、同様な処置により、heteroduplexを形成すると想定される。本法は、K-rasならびにp53変異の偽陽性を示す例が、膵癌細胞株の検討でも20%から25%に認められた。また、膵癌5例ならびに慢性膵炎10例の患者の膵液サンプルを用いて検討したが、膵癌症例ではK-ras変異は4例(80%)に、p53変異は3例(60%)に陽性を示したが、慢性膵炎症例でも高率にK-ras変異が6例(60%)に、p53変異が5例(50%)に陽性と判定され、非特異的反応に問題がみられた。様々な条件設定を工夫したが、擬陽性の原因として、PCR時のmisincorporationあるいは、MutSとの結合反応後の非特異的ビオチンの洗浄除去が完全にできないことがと考えられ、検出法の改良が必要と考えられた。, Recently, highly sensitive method of detecting genetic abnormalities including all single base mutations, as well as small deletions or insertions at any locations using Mut S mismatch binding protein was demonstrated in the experimental reports of Lishanski et al. and Wagner et al. I tried to apply this new method to detection of changes of cancer-related genes. First, DNA was extracted from 4 pancreatic cancer cell lines and pancreatic juice (PJ) from 5 patients with pancreatic carcinoma (PCa) and 10 with chronic pancreatitis (CP). Biotin-labeled sense primers for K-ras codon 12, exon 5 to 8 of p53, and exon 1 to 3 of p16 were synthesized. After the process of touchdown PCR amplification, heat denaturation and re-annealing, heteroduplex PCR products form in the case of presence of mispaired and unpaired bases and otherwise homoduplex PCR products alone form. Because of the specific binding of the heteroduplex not homoduplex to immobilized MutS protein on the nitrocellulose membrane, chemiluminescence method using streptavidin-HRP was performed for the detection of heteroduplex which is specific binding to MutS protein.
Among 4 pancreatic cancer cell lines, that is, PANC-1, PaCa-2, BxPC-3, and HPAF, PaCa-2 (homozygous mutation of K-ras codont 12) and BxPC-3 (no mutation of K-ras codon 12) would theoretically form homoduplex alone. PANC-1 and HPAF would also form heteroduplex due to heterozygous mutation of K-ras codon 12. On the other hand, p53 mutations were already detected in PANC-1 (exon 8), PaCa-2 (exon 7), BxPC-3 (exon 6), HPAF (exon 5) by direct sequencing. Therefore, as the same manner, these p53 mutations theoretically form heteroduplex. However, false positive was recognized in PaCa-2 for K-ras exon 1 and in PANC-1 for p53 exon 5, PaCa-2 for p53 exon 6, and BxPC-3 for p53 exon 7.Moreover, although the incidence of this heteroduplex using MutS assay was 80% (4/5) for K-ras exon 1 and 60% (3/5) for p53 in PJ with PCa, it was also 60% (6/10) for K-ras exon 1 and 50% (5/10) for p53 in PJ with CP.This detecting method has high sensitivity, but the problem of frequent false positivity.
The cause of the false positivity was regarded as the misincorporation during PCR and imperfect removal of non-specific biotion from the nitrocellulose membrane after the reaction with immobilized MutS binding protein. Further improvement will be needed for this detecting method., 研究課題/領域番号:11670486, 研究期間(年度):1999 – 2000, 出典：「MutSミスマッチ結合蛋白を用いた癌関連遺伝子異常検出法の消化器癌診断への応用」研究成果報告書　課題番号11670486
（KAKEN：科学研究費助成事業データベース（国立情報学研究所）） 
（https://kaken.nii.ac.jp/ja/report/KAKENHI-PROJECT-11670486/116704862000kenkyu_seika_hokoku_gaiyo/）を加工して作成, 金沢大学がん研究所},
 title = {MutSミスマッチ結合蛋白を用いた癌関連遺伝子異常検出法の消化器癌診断への応用},
 year = {2002}
}